导读：文章采用液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）的方法，测定犬灌胃给药升麻葛根汤颗粒后葛根素、芍药苷、异阿魏酸的药代动力学。该方法准确度强，专属性好，灵敏度高，可用于检测葛根素、芍药苷、异阿魏酸血药浓度的测定。

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常梦春,刘静静,刘勃缨,任静,张丽娜,李佳玮,刘志东.LC-MS/MS法测定升麻葛根汤颗粒在犬体内的药代动力学研究[J].天津中医药大学学报,,38(1):68-73.

CHANGMengchun,LIUJingjing,LIUBoying,RENjing,ZHANGLina,LIJiawei,LIUZhidong.StudyonthepharmacokineticsofShengmaGegendecoctiongranuleinbeagledogsbyLC-MS/MS[J].JournalofTianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,,38(1):68-73.

LC-MS/MS法测定升麻葛根汤颗粒在犬体内的药代动力学研究

常梦春1,2,刘静静1,2,刘勃缨1,2,任静1,2,张丽娜1,2,李佳玮1,2,刘志东1,2

（1.天津中医药大学,现代中药发现与制剂技术教育部工程中心,天津;2.天津中医药大学,天津市现代中药重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地,天津）

升麻葛根汤，方出自宋代阎孝忠的《阎氏小儿方论》，又名平血饮，后被收录于《太平惠民和剂局方》中，是方剂学“辛凉解表剂”的代表方。原方组成为：升麻2g，葛根3g，白芍2g，炙甘草2g。用法：研成粗末，每服三钱（9g），水一盏半，煎取一中盏，去滓。具有解肌透疹、辛凉解毒的功效。主治：麻疹初期，疹发不出，身热头痛，咳嗽，目赤流泪，口渴，舌红、苔薄而干，脉浮数。升麻性甘、辛，微寒，归肺、脾、胃、大肠经，具有发表透疹，淸热解毒，升举阳气的功效，为君药；葛根性甘、辛，凉，归脾、胃、肺经，为臣药，与君药升麻合用辛能达表，为透疹解肌之要药；白芍性味苦、酸，微寒，归肝、脾经，养血调经，敛阴止汗，柔肝止痛，平抑肝阳为佐药；炙甘草性味甘，平，归心、肺、脾、胃经，补脾和胃，益气复脉，调和药性，为佐使药。临床升麻葛根汤主要用于治疗乙型、丙型病毒性肝炎、药物性肝病、耳鼻喉科疾病、痘疹未发，或发而不畅等病症。

现代药理学研究表明，升麻中有机酸类成分主要有阿魏酸、异阿魏酸，具有抗炎、阵痛的功效，并以阿魏酸、异阿魏酸为指标控制其质量；异黄酮类化合物是葛根的主要活性成分，主要有葛根素、大豆苷、大豆苷元等，其中葛根素是葛根特有成分；白芍中主要含有成分为芍药总苷（TGP），包括芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷等。TGP具有抗炎、抗溃疡、抗病毒、免疫抑制等多种药理作用，对于类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等疾病有确切的治疗作用。本实验建立了液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）的方法测定犬血浆中异阿魏酸、葛根素、芍药苷的血药浓度，并对犬灌胃给予升麻葛根汤颗粒后异阿魏酸、葛根素、芍药苷的药代动力学进行了研究。

1材料

1.1仪器与试药

液质联用仪（美国Agilent公司，包括型高效液相色谱仪、型三重四级杆质谱仪，MassHunter工作站）；XW-80A型涡旋混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）；XP型十万分之一天平（METTLERTOLEDO）；ST16R型通用台式离心机（美国Thermo公司）。

升麻葛根汤颗粒（批号，由深圳华润三九医药股份有限公司提供）；异阿魏酸（批号-，含量以99.2%计，中国食品药品检定研究院）；葛根素（批号-，含量以95.5%计，中国食品药品检定研究院）；芍药苷（批号-，含量以96.4%计，中国食品药品检定研究院）；甲苯磺丁脲（批号，Sigma公司）；甲醇、乙腈均为色谱纯（购自FisherScientific公司）；甲酸为色谱纯（购自Fluka公司）。

1.1仪器与试药

Beagle犬，雌雄各半，体质量10~12kg，由沈阳军区总院实验动物科提供，许可证号：syxk（军）-。

2方法

2.1标准品溶液的配制

精密称取对照品约5.0mg，加甲醇溶解定容于25mL量瓶中，得浓度为μg/mL的标准品溶液，4℃低温保存备用。

2.2混标溶液的配制

精密移取各对照品1mL置于10mL量瓶中，加甲醇定溶至刻度，摇晃均匀，得浓度为20μg/mL的混标溶液，4℃低温保存备用。

2.3内标溶液的配制

精密称取甲苯磺丁脲对照品约5.0mg，加甲醇定容于25mL量瓶中，得浓度为μg/mL的内标溶液，4℃低温保存备用。

2.4色谱条件

色谱柱：WatersACQUITYUPLC?BEHC18柱（2.1mm×50mm，1.7μm，美国Waters公司）；柱温：25℃；流速：0.2mL/min；进样量：5μL；检测波长：nm；流动相：0.05%甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脱（0~2min，5%B~70%B；2~4.5min，70%B~%B；4.5~5.5min，%B~%B；5.5~6min，%B~%B；6~7min，5%B~5%B）。

2.5质谱条件

离子源：采用电喷雾离子源（ESI源）；检测方式：负离子检测；扫描方式：多反应离子监测（MRM）；干燥气：N2；干燥气温度：℃；干燥气流量：11L/min；雾化气压力：15psi；毛细管电压：0V，具体参数见表1。

表1芍药苷、异阿魏酸、葛根素的主要质谱条件

2.6血浆样品处理方法

取μL血浆加入μL内标溶液（甲苯磺丁脲2μg/mL），加入乙腈1mL，涡旋5min，00r/min离心5min，取1mL上清液，氮气吹干。加入μL甲醇复溶，涡旋5min，00r/min离心5min，取上清液进LC-MS/MS分析。

2.7所用软件（版本）及统计分析方法

使用WinNonlin6.4软件的非房室模型计算方法计算药代动力学参数。

3结果

3.1专属性

见图1（A），与对照组相比，心脑舒通在不同浓度范围内对正常培养C8-D1A细胞活力均没有影响，表明实验所选用心脑舒通的各浓度对胶质细胞均无毒副作用。分别取空白血浆、空白血浆加标准品和血浆样品，按照“血浆样品处理方法”处理后进样。结果表明，血浆中的内源性物质不干扰测定。见图1。

1.芍药苷；2.葛根素；3.内标；4.异阿魏酸

图1犬血浆LC-MS/MS色谱图

见图1（B），与对照组相比，模型组及心脑舒通不同浓度组均能提高OGD/R损伤C8-D1A细胞的增殖。与模型组相比，心脑舒通在10μg/mL时对OGD/R损伤的C8-D1A细胞有保护作用。

3.2标准曲线

取混合标准品溶液μL，氮气吹干，加入空白血浆μL，使芍药苷浓度为、、、、.2、.6、51.8、10.36ng/mL，葛根素浓度为、、、、、、52、10.4ng/mL，异阿魏酸浓度为、、、、、、53、10.6ng/mL，按照“血浆样品处理方法”处理后进样，建立标准曲线。以待测物浓度（ng/mL）为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权（W=1/x）法进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线。异阿魏酸回归方程为=9.X+5.，r2=0.；葛根素回归方程为=2.X+4.，r2=0.；芍药苷回归方程为=4.X-2.，r2=0.。

3.3提取回收率

取μL混标，氮气吹干，按“血浆样品处理方法”项下的方法分别制备低、中、高3个浓度的质量控制（QC）样品（n=6），所得样品浓度与除用混标复溶，按“血浆样品处理方法”项下的方法分别制备低、中、高3个浓度的质量控制（QC）样品（n=6）浓度相比，测定提取回收率。结果显示该方法的提取回收率均在61.55%±（1.06~81.71）%±2.82之间，RSD＜15%符合生物样品测定要求，结果见表2。

表2芍药苷、葛根素和异阿魏酸的提取回收率与基质效应（n=6）

3.4基质效应

取空白血浆μL，除去用混标复溶外，按“血浆样品处理方法”项下的方法分别制备低、中、高3个浓度的质量控制（QC）样品（n=6），所得的峰面积与标准品溶液直接进样所得峰面积相比，测定基质效应，结果显示不存在明显的基质效应，结果见表2。

3.5精密度及准确度

取空白血浆μL，按“血浆样品处理方法”项下的方法分别制备低、中、高3个浓度的质量控制（QC）样品（n=6），在同日内用同一条标准曲线进行处理、分析，得到日内精密度RSD、日间精密度RSD和准确度RE。结果表明4个化合物日内精密度RSD＜15%、日间精密度RSD＜15%，准确度偏差RE值均在±15%以内，均符合目前生物样品分析方法指导原则的有关规定，结果见表3。

表3方法的精密度和准确度测定结果（n=6）

3.6稳定性

取空白血浆μL，按“血浆样品处理方法”项下的方法分别制备低、中、高3个浓度的质量控制（QC）样品（n=6），考察样品在室温放置24h（short-termstability）、-20℃反复冻融3次（freeze-thawstability）、-20℃冻融30d（long-termstability）。结果显示4个化合稳定性RE值均在±15%以内，表明芍药苷、葛根素、异阿魏酸在上述条件下可保持稳定，结果见表4。

表4犬血浆样品中芍药苷、异阿魏酸和葛根素在不同储存条件下的稳定性（n=6）

3.7药动学研究

取受试犬6只，给药前禁食12h，自由饮水。灌胃给予升麻葛根汤颗粒，剂量9g/只（成人一天给药剂量为9g）。于给药前0h及给药后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10、12、24h取犬前腿静脉血2.5mL，置肝素离心管中，r/min离心10min，分离血浆至试管中，-80℃冷冻待测，作为血浆样品。测定时，取样品血浆按“2.6”项下方法处理，进样测定血药浓度，并计算芍药苷、葛根素、异阿魏酸的血药浓度，绘制平均药时曲线，结果见图2。

图2犬灌胃给药升麻葛根汤颗粒后芍药苷、异阿魏酸和葛根素

血浆药物浓度时间曲线（n=6）

4讨论

本实验对血浆样品中3种成分的提取方法进行了考察：甲醇沉淀、乙腈沉淀、乙酸乙酯提取、叔丁基甲醚提取，结果发现乙睛沉淀无内源性物质干扰，重现性好，可达实验测定要求。考察了不同比例甲醇-甲酸水、乙睛-甲酸水及乙睛-甲酸铵、乙睛-乙酸铵作为流动相，发现本实验所建立的流动相梯度洗脱程序能有效地将3个成分和内源性成分分离。

HPLC法同时检测异阿魏酸、葛根素、芍药苷的含量及指纹图谱文献多有报道，单个化合物的药代动力学也有较多文献研究，但是3种化合物同时检测未见报道。本文以甲苯磺丁脲为内标物质，采用LC-MS/MS建立了犬灌胃给予中药复方“升麻葛根汤”颗粒后血浆中异阿魏酸、葛根素、芍药苷的含量测定方法，为升麻葛根汤颗粒的质量控制及药理作用研究提供了依据。芍药苷属于苷类、中性化合物，正负离子检测模式均可，本实验通过条件优化结果比较可知，负离子检测模式较好，适合芍药苷的体内分析及药动学研究，具有较好的参考价值。该方法具有较高的专属性、灵敏度，且提取回收率和基质效应、精密度与准确度、稳定性均符合生物样品测定要求。

基金项目：天津市自然科学基金（15PTCYSY，16ZXHLGX）。

作者简介：常梦春（-），女，硕士研究生，主要从事中药制剂学。

通讯作者：刘志东，E-mail：lonerliuzd